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技術文章

流感病毒分離標準操作規程（SOP） 轉
 病毒分離
分離病毒是診斷病毒性***常用，并且高度敏感的方法之一。分離出的病毒須經**
學、基因分析或電子顯微鏡等進一步鑒定確診。病毒可長期保存，亦可用來作抗原性、
基因特性或**敏感性等分析。病毒分離亦受一定限制。目前用于分離病毒的組織細胞
種類有限，每種細胞只能用來分離培養一或數種病毒。MDCK（狗腎細胞）是目前用于分
離培養流感病毒*常用的細胞系。
分離流感病毒*常用的活體是雞胚，目前有些實驗室用MDCK細胞代替雞胚分離培養流感
病毒。由于MDCK細胞屬腫瘤細胞系，故用該細胞分離的病毒不能用于疫苗生產。各實驗
室應同時采用雞胚和MDCK兩種方法分離病毒，不應放棄用雞胚分離病毒的方法。

流感病毒細胞分離標準操作規程

材料：1、細胞瓶或細胞管培養成片的MDCK細胞
2、TPCK處理胰酶（牛胰腺來源XIII型）Sigma Cat. # T-8642
3、HEPES 緩沖液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-023
4、D-MEM培養基，GIBCO BRL Cat. # 11965-092
5、青、鏈霉素母液（10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 ?g/ml 硫酸鏈霉素） ，GIBCO BRL
Cat. # 15140-023
6、牛血清白蛋白組分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-011
7、放置于2ml wheaton 小瓶中的臨床樣品
8、T-25培養瓶用于病毒培養，（組織培養管也可被應用，若樣本量大的話應選用培養瓶
，細胞數量按規定調整。）
9、1ml 滴管
10、10ml 滴管
培養基和試劑的準備：（建議：要求經常檢查試劑使用的有效期）
500 ml D-MEM液中加入：
青、鏈霉素母液5 ml （終濃度達: 100 U/ml 青霉素and 100 ?g/ml 鏈霉素）
牛血清白蛋白12.5 ml （終濃度: 0.2 %）
HEPES緩沖液12.5 ml （終濃度: 25 mM）
病毒生長液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液濃度為2m
g/ml ）使TPCK-胰酶的濃度為2 ?g/ml。
方法：（所有有關病毒分離的操作都應在生物**Ⅱ實驗室中進行，必須遵守生物**
規定，嚴格執行標準操作規程和廢棄物管理規定。進入生物**Ⅱ實驗室要求著必要的
個人防護用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防護眼鏡）

程序：
Ⅰ 細胞培養瓶的準備
1、顯微鏡檢查細胞生長狀態，40倍放大。
2、用病毒培養液替代細胞生長液，保證使用合適的病毒培養基。
3、輕輕倒出細胞生長液于廣口瓶中，用6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗細
胞3遍。
Ⅱ 細胞培養瓶的接種
1、用無菌的移液管將D-MEM從細胞培養瓶中移出。
2、用無菌的移液管吸取200 ?l臨床樣品置于細胞培養瓶中。
3、接種物370C吸附30分鐘。
4、加6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的完全D-MEM液于細胞培養瓶中。

5、每細胞培養物的收獲日檢測細胞病變。（細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙
增大。細胞核固縮或破裂。嚴重時細胞部分或全部脫落）
Ⅲ 細胞培養物的收獲
1、當細胞病變為3+或4+時，收獲細胞懸液并加穩定劑如：甘油或終濃度為0.5%的牛血清
白蛋白。即使無細胞病變也應該于6-7天收獲。
2、進行紅細胞凝集實驗并40C保存。如沒有紅細胞凝集現象在報告不能從樣品中分離病
毒前，應再傳代2-3次。
3、如果有必要，應3000轉離心5分鐘以去除剩余的細胞。通過血凝抑制實驗鑒定分離物
，并在收獲的**間將分離物保存在-70oC條件。

流感病毒雞胚分離標準操作規程
材料：雞胚10日齡
照卵燈
70%酒精
針頭, 22 號, 1? 英寸
1ml注射器
雞卵開孔器
膠水或清漆
15ml 管和架子
10ml 移液管
無菌鑷子
方法：（所有有關病毒分離的操作都應在生物**Ⅱ實驗室中進行，必須遵守生物**
規定，嚴格執行標準操作規程和廢棄物管理規定。進入生物**Ⅱ實驗室要求著必要的
個人防護用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防護眼鏡）
程序：
I.驗卵
1、用照卵燈檢測雞胚，并將雞胚的盲端放置在蛋盤上。
2、如果雞胚是沒有受精、有裂痕、發育不全、或表面有好多滲水孔，應掉。
II.雞胚接種
1、將雞胚的盲端放置在蛋盤上，標記每個雞胚用特定的鑒定數量（通常每個樣本接種3
個雞胚）。
2、用70%乙醇**雞胚，在氣室端鉆孔。每份標本接種3個雞胚。
3、用注射器吸1ml處理過的臨床標本，裝上22 號（ 1? 英寸）針頭。
4、將雞胚置于蛋架上，用短促動作刺破雞胚羊膜，將100 ?l臨床標本注入雞胚羊膜腔。
將針頭退出至? 英寸，將另外100 ?l臨床標本注入雞胚尿囊腔。
5、用同一注射器和針頭將同一標本依上法接種另外的兩枚雞胚。
6、將針頭棄于合適的生物**裝置中。
7、滴石蠟或膠水封口。
8、33-34oC 溫箱培養雞胚2-3 天。
提示：禽流感需35?C or 37oC培養，哺乳動物流感病毒35oC培養（禽流感在35?C也會生
長良好！）
III.雞胚收獲
1、雞胚在收獲前應4oC過夜或至少放置4小時。
2、標記15ml 塑料管與相應的雞胚編號一致。用70%乙醇**雞胚頂部。
3、用無菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開雞胚尿囊膜。用10ml 吸管吸雞胚尿囊液置于相
應的收集管中。用注射器和針頭刺破雞胚羊膜，盡量吸取羊水放置于另外的管中。由于
羊水較少可以將3個雞胚的羊水合并。
4、將雞胚收獲液3000轉離心5分鐘去除血液和細胞。進行紅細胞凝集實驗并4oC孵育30分
鐘。如沒有紅細胞凝集現象在報告不能從樣品中分離病毒前，應再雞胚傳代2次。
5、如果有必要，應3000轉離心5分鐘以去除剩余的細胞。通過血凝抑制實驗鑒定分離物
，并在收獲的**間將分離物保存在-70oC條件下。
注意事項
I.不要在-20oC條件下保存病毒分離物，應該溫度條件下流感病毒極不穩定。
II.流感病毒實驗室毒株和臨床檢測樣本的交叉污染問題：流感病毒操作要求生物**規
程。當在同一工作區域內操作臨床樣本和已知流感病毒時應該有特殊警示。有些實驗室
用已知的病毒作為陽性控制，而且有將商用推薦病毒作為質量確證程序。這些病毒由于
其極優的生長特性被選擇出來。因此這些毒株常與臨床檢測樣本發生交叉污染。*好在
流感流行季節前準備該類病毒。如果在此期間必須補充這類病毒的話，必須與處理臨床
標本的時間分開。應盡量將已知病毒和未知材料在不同時間、不同生物**柜、不同房
間進行操作。
：
III.實驗室污染的鑒定：由于試驗室已知毒株和商用推薦病毒都是實驗室適應的，有良
好的生長特性，通常滴度較高。用推薦血清做抗原分析和基因序列分析可以確定污染狀
況。

重要原則：
禁止在同一實驗室，同一時間處理接種未知臨床標本和已知標準病毒。
禁止在同一實驗室，同一時間處理接種采自不同動物的標本；動物標本（如豬、禽等）
必須與人的標本分別保存。