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技術(shù)文章

組織切片的制備
組織切片的制備

（一）石蠟切片的制備
1.及時固定組織：應(yīng)采用10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用濃甲醛液1份加蒸餾水9份稀釋）固定組織，因甲醛易氧化成甲酸，因此多會偏酸性，*理想的是配成中性甲醛液。巨大組織要切開固定，小塊組織的固定時間約4小時左右，然后取材時修切成大小約22x22mm，厚不超過2mm的組織塊進(jìn)行脫水。取材時必須注意核對編號是否與送檢單上的病理號一致，并記錄好對大體標(biāo)本的描述，取材組織的形狀和數(shù)量。
2.脫水徹底：脫水液常用乙醇，用乙醇脫水要由低濃度逐級上行至高濃度（一般70%~100%的濃度），逐步置換組織內(nèi)的水份。組織在乙醇脫水時，低濃度乙醇的時間可適當(dāng)延長，高濃度乙醇脫水時間不能過長。
3. 透明充分: 透明液多采用二甲苯，組織脫水后轉(zhuǎn)入二甲苯，依據(jù)組織的大小、厚薄，約置30~90分鐘。
4. 浸蠟足夠:浸蠟多用純凈而熔點稍低(56~58度)的石蠟，浸蠟時采用三級或四級，以盡量**二甲苯。浸蠟時間依據(jù)組織大小厚薄而定，一般為1~2少時。浸蠟時包埋機所設(shè)定的溫度應(yīng)比所用石蠟熔點稍高以保持石蠟恰在熔溶狀態(tài)。這樣，組織才能取得良好的浸蠟效果。如浸蠟溫度過高，導(dǎo)致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。
5.包埋恰當(dāng):包埋時，包埋石蠟的溫度要比組織高(約3~5度)，否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時，動作更要迅速，否則容易導(dǎo)致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋是時把組織*大*平切面或所需是病灶切面向下，對皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應(yīng)包含有各層組織。
組織包埋完后，要與取材時記錄的組織形狀和數(shù)量核對，發(fā)現(xiàn)問題，及時解決。
6.切片要薄:切片首要任務(wù)是把切片刀研磨鋒利，這是能否切薄而平整切片的關(guān)鍵。其次要把刀架上的切片**角調(diào)至2~5度，在此角范圍內(nèi)，才能切出良好蠟片。如使用一次性刀片，可轉(zhuǎn)動刀座上的弧形刻度盤選取*合適的刻度(該合適刻度并不等于真正的切片**角)。切片前要把切片機上有關(guān)的各螺旋擰緊，如沒有擰緊或包埋少組織蠟塊過硬時就會出現(xiàn)跳片，使蠟片成一截厚一截薄。切片的厚度應(yīng)為3~4μm，對一些組織如**結(jié)、鼻咽和扁桃體，切片的厚度應(yīng)為2~3μm。
7.貼片烤片：切出的蠟片應(yīng)放在恒溫貼片盆內(nèi)展開，并根據(jù)所用包埋石蠟的溫度調(diào)節(jié)水溫在42~46度左右。為了利于展平蠟片，可先把蠟片放在一缸缸約10~15%乙醇內(nèi)，然后用玻片再將蠟片移至恒溫貼片盆，由于水的表面張力比乙醇大，蠟片由乙醇移至水后就很容易展平。貼片時再注意“定點”和“定向”。*后即可置入約60~65度的烤片箱內(nèi)烤15~30分鐘，也可放在熱板上烘干，蠟片就可牢固地粘附在載玻片或蓋玻片上。
8．切片在染色前必須脫蠟干凈：未完全脫蠟的組織切片，染色后組織和細(xì)胞模糊不清。脫蠟要用兩級或三級脫蠟劑如二甲苯，時間為10~20分鐘，應(yīng)視所用二甲苯的新舊以及室溫情況而定。脫蠟時間寧可長些，不應(yīng)過短。
9.蘇木素染液一定要配好:蘇木素液配制的好壞，決定染色的優(yōu)劣。蘇木素配制有多種配方，關(guān)鍵在于氧化。如加氧化汞作氧化劑時，要防止氧化過度，同時注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸鈉作氧化劑時，就無需把蘇木素液煮沸。要配制自然成熟的蘇木素則不需加氧化劑，但要較長時間才能氧化成熟。不同蘇木素染液的染色時間為5~20分鐘，自然氧化成熟的蘇木素液染色時間可以更長。
（二）冰凍切片的制備
1.取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，*好為24×24×2mm。
2.取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。
3.將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。
4.調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。
5.調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r，切出的切片能在**時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。
6.應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和**結(jié)時，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10--15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應(yīng)調(diào)至-30℃。
優(yōu)點
1．簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)
冰凍切片時的注意事項
　　①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
　　②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。
　　③放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。
　　④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。
　　⑤當(dāng)切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。
　　⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當(dāng)附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。
冰凍切片的快速染色法
　　冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當(dāng)切片附貼于載玻片后，即用電吹風(fēng)吹干后再固定。根據(jù)實驗對比認(rèn)為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。
　　方法：
　　① 切片固定30秒－1分鐘。
　② 水洗。
（三）細(xì)胞爬片的制備
1 載玻片的處理：用肥皂水將載玻片洗凈，自來水沖洗，晾干，再將載玻片
浸泡在洗液中2~3 小時，取出后再用自來水沖凈，蒸餾水沖洗三遍，用干凈的紗
布將載玻片擦干，放在飯盒中，置170℃干烤5 小時****。
2.細(xì)胞爬片培養(yǎng)
取原代細(xì)胞一瓶，用吸管吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆滿瓶底。室溫放置5分鐘后鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底向上。將胰蛋白酶吸去，加入約2ml含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞從瓶壁上吹打下來，制成細(xì)胞懸液，滴于已處理好的載玻片上，每張片子1~2滴，注意:滴于載玻片后1/3 的位置，且不能有汽泡。放在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜。
3 細(xì)胞的固定
將已培養(yǎng)過夜的細(xì)胞爬片從5%CO2 培養(yǎng)箱取出，用PBS 將培養(yǎng)液洗去，放在冷乙醇中室溫固定30分鐘后，取出爬片放置在切片盒內(nèi)-20℃儲存，待**組
化染色。